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Invitrogen Qubit 4荧光计

名称：Invitrogen Qubit 4荧光计

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产品简介：
适合样品珍贵、对准确性要求极高的应用领域
品牌：Thermofisher（Invitrogen）

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Invitrogen Qubit 4 荧光计

尤其适合样品珍贵、对准确性要求极高的应用领域

哪些用户需要使用Qubit 4 荧光计？

如果您的样品十分珍贵或用于精密应用领域，或者您为了获得研究结果进行了巨大的投入，那么Invitrogen™ Qubit™ 4 荧光定量计就是您的理想之选。想想下面这些问题：

— 需要快速检测RNA 样本的完整性和质量？ — 我的样品十分珍贵而且难以处理吗？

— 提取后的DNA、RNA 或蛋白质量很少吗？ — 该样品将被用于成本高昂的下游实验吗？

— 我要使用诸如实时定量PCR (qPCR) 或下一代测序方法等需要精密测定的实验方法吗？

— 我要进行诸如转染等需要几天甚至几周才能获得结果的实验吗？

— 我的样品制备过程复杂而且需要诸如激光捕获显微切割等特殊技术吗？

为什么要使用Qubit 4 荧光计？

Qubit 4 荧光计采用专门研制的荧光检测技术和Invitrogen™ Molecular Probes™ 染料。这些染料荧光只有与特异性的靶分子结合时，才能发射荧光信号，即使有游离核苷酸或降解核酸存在，这些染料仍能发挥作用。Qubit 4 荧光定量即便在低浓度下亦具有目前最高的DNA 和RNA 定量特异性和灵敏度。

※ 选择性 — Qubit 荧光定量( 图1) 采用Qubit 分析试剂盒( 表1)，其包括专利的染料，只有与DNA、RNA 或蛋白质结合时方可发出荧光。由于Qubit 技术只报告靶分子( 而不是杂质) 的浓度，因此这种特异性可以使您获得十分精确的结果

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图1. Qubit 荧光定量系统。

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表1. Qubit 分析试剂盒的分析范围。

※ 灵敏性 — 最低仅需1 uL 样品，能精确可靠地定量浓度仅为10pg/_L 的DNA 和12.5μg/mL 的蛋白质样本

※ 简单直观 — 反应灵敏的5.7 英寸彩色触摸屏，直观的导航按钮

※ 迅速 — 全新的双核处理器，5 秒内快速计算样品浓度，最多存储1000 个结果

※ 个性化 — 个性化设置常规应用，可通过MyQubit 软件和网络工具创建个性化assay，六国操作语言可供选择

上市12 年来，Qubit 荧光计一直以其极高的准确度和灵敏性，受到全球上万个实验室的青睐。迄今为止，已经有17,500 篇有关Qubit 的文献引述。最新推出的Qubit 4 荧光计秉承上一代仪器的高准确性，不仅仅可精确测量样品DNA，RNA 和蛋白质含量，还拥有全新的功能，包括：

※ 适用全新RNA IQ assay — 快速可靠地检测RNA 完整性和质量

※ 数据导出 — 除U 盘和USB 连接电脑导出数据，还拥有WiFi 功能

※ 内置试剂计算器 — 快速计算配置工作溶液所需的染料和缓冲液

Qubit 荧光定量的工作流程

Qubit 荧光定量采用荧光染料对目标生物分子进行定量

采用Qubit 4 荧光计完成的Qubit 分析均采用同一种通用实验方案。进行DNA 和RNA 分析只需混合然后读数，孵育时间仅为2 分钟，蛋白质分析孵育时间为15 分钟( 图2)。请登录 thermofisher.com/qubit，查看Qubit 分析的实验方案。实验完成，Qubit 4 荧光计会自动保存您的实验数据，最多1000 个。此外，您也可以通过U 盘，USB 数据线或WiFi 导出数据。

将染料和缓冲液置于室温下储存，以获得最佳结果。DNA、RNA和蛋白质标准品置于4℃储存。使用前，确保所有分析试剂均在室温下。

* 除了常用的 dsDNA, oligos, total RNA, microRNA, RNA IQ 和 protein 分析之外，使用Ion Sphere Quality Control Kit，还可用于检测Ion Sphere Particle 的质量，以用于Ion PGM 测序仪。

图2. 采用Qubit 4 荧光计进行Qubit 分析的工作流程。

Qubit 操作简单直观

内置试剂计算器。输入样品和标准品的数量，使用此工具可帮助您快速计算配置工作溶液需要的染料和缓冲液。

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Qubit 荧光定量与NanoDrop及其它紫外分光光度计定量方法有何不同？

Thermo ScientificTM NanoDropTM 及其它紫外分光光度计均采用紫外吸光度进行检测，它无法区分出DNA、RNA、降解核酸、游离核苷酸及其它杂质。而Qubit 定量平台采用荧光染料检测特异目标分子的浓度。

尽管紫外吸收定量法是最常用的一种DNA 或RNA 定量方，但其读数并不可靠且不精确(1-4)。紫外吸光度读数不加区别检测吸光度为260nm 的所有物质，包括DNA、RNA、蛋白质、降解核酸和游离核苷酸。由于Qubit 4 荧光计只检测目标分子，因此其读数一般低于A260 读数，定量更精确。

此外，分光光度计的灵敏度不足，无法完成低浓度DNA 和RNA的定量。相反，Qubit 4 荧光计能在较低的浓度范围内得出比采用NanoDrop 分光光度计进行紫外吸收检测更准确、精密的结果( 图3)。鉴于上述缺点，使用荧光染料定量核酸已成为一种常见的替代方法[5–8]。

低浓度下的准确度和精度比较

Qubit 荧光定量能在较低的浓度范围内得出比采用NanoDrop分光光度计进行紫外吸光度检测更准确、更精密的结果。采用Qubit dsDNA HS 分析试剂盒及Qubit 荧光计，定量浓度仅为10pg/_L 的样本中的DNA，测得值在实际值的±12% 范围内( 图3A)。而采用NanoDrop 分光光度计测量上述相同样本，测得的浓度比实际值高46 倍。使用Qubit 荧光计检测低至10 ng/_LDNA 的样本(NanoDrop 分光光度计的报道下限值为2 ng/_L)，测得值在实际值的±1% 范围内，使用NanoDrop 分光光度计测定的浓度在实际值的±5% 范围内。此外，采用Qubit 荧光计检测DNA 浓度低至0.5 ng/_L 的样本，所有样本的重复差异(%CV)均_1% ( 图3B)。而采用NanoDrop 分光光度计检测，只有DNA浓度为4ng/_L 及以上的样本的%CV 低于9%。

图3. Qubit 荧光定量的准确度和精度。根据标准试剂盒实验方案，在Qubit 荧光计中采用Qubit dsDNA HS 分析试剂盒重复10 次测量浓度在0.01至10ng/_L 之间的lambda DNA。同时采用NanoDrop ND-1000 分光光度计重复10 次测量相同浓度的DNA，比较结果的准确度(A) 和精度(B)。准确度定义为与已知浓度的平均偏差。标示的浓度是在Qubit 分析管中稀释前起始样本的DNA 浓度。

针对DNA 或RNA 的选择性比较

采用Qubit 荧光定量和紫外吸光度测量核酸浓度最明显的差异在于Qubit 分析的选择性，Qubit 分析针对目的分子具有极高的特异性，可提供较紫外吸光度更准确的信息。采用紫外分析时，同时含有DNA 和RNA 的样本结果无差别，您无法将它们DNA和RNA 区分开来。而Qubit 荧光定量能够准确测定同一样本中的DNA 和RNA ( 图4)。在本实验中，样本含有相同含量的DNA和RNA，采用Qubit dsDNA BR 分析试剂盒测得的DNA 浓度在实际含量的±2% 范围内。此外，在RNA 含量较DNA 高10倍的样本中，采用DNA 分析测得的浓度仅比实际值高7%。而采用NanoDrop 分光光度计进行紫外吸光度检测，无法准确测量上述样本中的DNA 和RNA 含量，这增加了后续实验中出错的可能性。

图4. Qubit 分析与紫外分光光度法相比具有选择性。采用Qubit dsDNABR 和Qubit RNA BR 分析试剂盒及Qubit 荧光计，按照试剂盒实验方案检测含有lambda DNA (10 ng/uL) 和不同量的大肠杆菌核糖体RNA (0-100 ng/uL) 的样本，每个样品重复3 次。然后采用NanoDrop ND-1000分光光度计检测同一样本三次，采用PerkinElmer Lambda 35 分光光度计检测一次。标示的浓度是在Qubit 分析管中稀释前起始样本的DNA和RNA 浓度。红色和橙色趋势线分别表示起始样本中DNA 和RNA 的实际含量。( 分别) 稀释纯的浓缩DNA 和RNA 溶液，采用PerkinElmer Lambda 35 分光光度计测定260 nm 处的光密度，使稀释后溶液的光密度值为1.0，设定核酸的实际浓度。然后计算储液浓度，用于后续稀释。采用紫外分析时，同时含有DNA 和RNA 的样本结果无差别- 您无法将它们区分开来。

灵敏度和范围比较

采用Qubit 荧光计及Qubit 分析试剂盒的灵敏度高于紫外吸光度检测，由于该分析能够检测1–20uL 的样本，因此分析的有效范围进一步扩大。Qubit dsDNA HS 和BR 分析试剂盒覆盖的样本浓度范围为10 pg/uL 至1 ug/uL DNA。据制造商报道，NanoDrop 分光光度计覆盖的样本浓度范围为2 ng/uL 至15 ug/uL，由此可见，Qubit 适合的浓度范围更宽，不过，高浓度样本在分光光度计上测定就不必稀释。

如何创建个性化的分析应用？

荧光计模式

选择荧光计模式，Qubit 4 荧光计就可以被用做小型的荧光计。在荧光计模式里，不同于使用分析试剂盒时的校准和基于算法的计算结果，仪器直接产生并显示每个样本的原始荧光数据(RFU)。荧光计模式允许您可以手动选择发射光源：蓝色LED ( 最大~470nm) 或红色LED ( 最大~635 nm)。如果选择蓝光发射，仪器读取绿色或远红外通道的荧光；如果选择红光发射，则仅读取远红外通道的荧光。

通过荧光计模式收集的数据可以用于设计您的个性化assay 配合MyQubit 创建新的分析类型。

MyQubit- 为Qubit 4 荧光计设计和创建新的分析类型

Qubit 4 荧光计与MyQubit assay 设计工具兼容。您只需在此在线工具上输入您的assay 参数，保存并上传.qbt 文件至您的Qubit 4 荧光计，即可运行您的个性化分析，拓展Qubit 的应用范围。

* 目前，我们已开发6 个新的分析( 胆固醇、葡萄糖、半乳糖、谷氨酸、过氧化氢、蔗糖分析)，如有需要可直接下载上传至您的Qubit。

Qubit RNA IQ Assay

快速、准确地检测RNA 完整性和质量

RNA 样品的质量评估对于下游的实验的成功尤为重要。全新上市的InvitrogenTM Qubit RNA IQ（Integrity & Quality ）试剂盒和Qubit 4 荧光计配套使用，只需两步就可以准确区分完整和降解RNA，快速评估RNA 质量或降解程度。无需特殊的处理步骤，繁杂的样本制备或漫长的等待过程——最少仅需1 uL，浓度为0.5-1.5 ug/uL 的待测样品，即可在4 秒内获得RNA IQ 结果。

Qubit RNA IQ 试剂盒采用两种独特的荧光染料——一种与大RNA，完整和/ 或结构RNA 结合，另一种选择性地结合较小、降解的RNA（图5），两种染料结合使用，可快速地评估RNA样品的完整性和质量。使用时，您只需将样本加入RNA IQ 工作液，然后在Qubit 4 荧光计上完成检测。检测结果会提供RNA 样品完整性和质量的总数值或RNA IQ#，以及样本中大小RNA 的百分比值（图6）。与其他RNA 质量分数类似，RNAIQ# 评分范围为1 到10，数值越大，说明RNA 的质量越高，完整性越好。

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图5. RNA IQ 试剂选择性结合大RNA 和小RNA。三个含相同100 ng/mL rRNA (E. coli) 和不同含量siRNA (0 to50 ng/uL) 的样本都使用 Qubit RNA IQ assay (Q33221, Q33222) 在 Qubit 4 荧光计上检测。A 图和B 图分别展示了相对荧光单位值RFUs) (A) 和IQ# 值 (B) 。

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图 6. Qubit 4 荧光计和QubitRNA IQ 结果

与电泳法相比，RNA IQ 检测法有何优势？

Qubit RNA IQ 为检测RNA 样本是否降解提供一种快速简单的方法。与基于微流体芯片法比较，RNA IQ 法需要的设备便宜，操作简单，更重要的是检测所需的时间大大缩短。通常来说，完成12 个样品的检测，RNA IQ 法约需要10 分钟，而使用微流体法，约需要75 分钟。如果您只是需要简单评估RNA 样品是否降解，可以使用RNA IQ 法快速完成检测，但如果您需要获取具体的RNA 片段大小及分布信息，我们依然推荐您使用基于凝胶或微流体的电泳方法。

RNA IQ 检测结果反映样本中大RNA 和/ 或结构RNA 和小RNA的百分比，其数值与电泳法结果正相关（图7）。然而，需要注意的是IQ# 值反映的是样本中大小RNA 的比值，由于计算原理不同，IQ# 值与其他质量评估方法得到的结果之间存在一些差异（图8）。对特定样本或下游应用，我们推荐您最开始同时使用RNA IQ 试剂盒和传统电泳法来确定测量值的相关性。

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图 7. rRNA 经RNase 酶处理，随后用Qubit RNA IQ Assay或 Agilent Bioanalyzer™ 仪器评估完整性和质量。将750 fMRnase A 加入相同量的 100 ng/mL rRNA (E. coli) 溶液中，在不同的时间点用RNase OUT 处理，然后用Qubit RNA IQ Assay 在Qubit 4 荧光计 (A) 仪器或 AgilentBioanalyzer™ Prokaryote TotalRNA Nano chip (B) 检测。

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图 8. 总RNA 经RNAase 处理1 min 后，使用 QubitRNA IQ assay 和 Agilent Bioanalyzer™ 仪器检测RNA 完整性和质量。 rRNA 经0.5pg/μL RNase A 处理，1 min 后加入 RNaseOUT 。样品通过 ProkaryoteTotal RNA Nano Chip 或Qubit RNA IQ Assay （货号：Q33221, Q33222) 在 Qubit 4 荧光计上检测。质量分数的差异，IQ#: 9.8 和 RIN#: 8.9 是 5s rRNA 和 tRNA 展示三级结构和结合大RNA 染料的信号结果。

仪器参数：

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